Am 26.04.23 besuchten wir, die Klassen 6a, 6b und 7b im Rahmen vom Wahlpflichtfach Biologie das Spezial-Praktikum im Vienna Open Lab zum Thema „Targeted Protein Degradation“. Bei diesem Workshop ging es um die Selbstreinigung der Zelle zum Abbau von Proteinen. Um diesen Abbau zu erforschen, verwendeten wir die Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) und Hefe (Saccharomyces cervisiae), beide dieser Organismen werden als Modell verwendet, da sie sich schnell fortpflanzen.
Wir arbeiteten in drei Gruppen mit dem Ziel der Experimente, den Abbau von Proteinen anhand eines Reportersystems für das Auge sichtbar zu machen. Zusätzlich untersuchten wir welche Aminosäuren diesen Abbau in Gang setzen.
Wir führten zuerst das Experiment mit Arabidopsis thaliana durch:
Hierfür reinigten wir das Well zuerst mit destilliertem Wasser (dH2O) drei Mal und entfernten es, sodass kein Wasser übrigbleibt. Im Anschluss gaben wir Aceton in das Well und inkubierten die Well-Plate, danach reinigten wir diese wieder mit dH2O. Nachdem wir die Färbelösung (X-Gluc) hinzufügten Inkubierten wir die Well-Plate für ungefähr 90 Minuten.
Währenddessen führten wir das Experiment mit Saccharomyces cerevisiae durch:
In die Hefe-Pellets gaben wir ungefähr drei Tropfen Chloroform und zwei Tropfen Sodium dodecyl sulphate (SDS), danach mischten wir es zusammen und erhitzten es bei 28°C für 5 Minuten. Anschließend haben wir 200 Mikroliter ONPG- Lösung in jedes Pellet hinzugefügt und die gelbe Verfärbung abgewartet. Um diese Reaktion zu beenden fügten wir 500 Mikroliter 1M Natriumcarbonat (Na2CO3) hinzu. Danach haben wir beide Mischungen für 10 Minuten zentrifugiert und 1ml der Lösung in eine Küvette übertragen. Zum Vergleich mischten wir in ein Reaktionsgefäß 400 Mikroliter ONPG-Lösung und 1000 Mikroliter 1M Na2CO3, davon gaben wir 1ml in eine Küvette als Blank-Wert. Zur Analyse des Reporter Proteine wurde die optische Dichte im Photometer ausgewertet. Bei einem funktionalen Reporterprotein betrug der Wert in etwa 1500 Miller-Units und bei einem dysfunktionalen beträgt dieser in etwa 1 Miller-Unit. Bei der Lösung mit Arginin (R) verfärbte sich die Hefe-Mischung nicht, bei der Lösung mit Valin (V) jedoch schon. Das heißt, dass Arginin abgebaut wird und Valin in den Zellen noch besteht.
Nach der Analyse der Hefe, nahmen wir die Well-Plate mit der Arabidopsis thaliana aus dem Inkubator heraus und analysierten die Verfärbung. Beim Arginin R- blieb die Farbe Grün weitgehendst unverändert, bei Arginin R+ mit Bortezomib versetzt färbte sich die Pflanze ein wenig dunkler. Methionin M- verfärbte sich türkis, M+, wieder mit Bortezomib versetzt, wurde dunkel-türkis bis bläulich.
Bortezomib ist ein Medikament welches gegen Krebs eingesetzt wird. Es verhindert das schnelle Wachstum der Krebszellen, indem der Abbau bzw. die Produktion der Proteine unterbunden wird. Deshalb waren die Farben der Pflanzen, die mit Bortezomib versetzt wurden dunkler.
Sophie Pritisanac 7b